Western Blot內(nèi)參抗體選擇原則

內(nèi)參抗體 種類很多，比如beta-actin、beta-tubunlin、GAPDH、α-tubunlin等，那么針對自己的實驗，我們該如何選擇呢?下面簡單介紹下選擇內(nèi)參抗體應(yīng)遵循的原則：

 

一.樣本種屬來源：

 

先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。

1、哺乳動物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atp ase等。

2、植物來源實驗樣本，則可以選擇plant actin、Rubisco等。

3、其他來源樣本研究較少，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報導(dǎo)，選擇合適的蛋白 作為內(nèi)參。

 

二.目的蛋白分子量 ：

 

選擇內(nèi)參抗體時，應(yīng)該考慮目的蛋白分子 量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD，此時不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。

 

三.目的蛋白表達(dá) 部位：

 

就一般的蛋白檢測來說，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了，而針對于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時，選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價值。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等，在一些文獻(xiàn)報道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。
 

以上幾條原則只是針對通常情況，但是需要注意的問題是——內(nèi)參的選擇需要考慮實際的試驗環(huán)境，比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參。比如在涉及細(xì)胞增殖相關(guān)試驗中，c-Jun由于自身表達(dá)變化就不適合做內(nèi)參;而在凋亡實驗時，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)參。因此設(shè)計實驗方案的時候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實驗過程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素。