western blot的作用

免疫印跡是一個用于蛋白質(zhì)分析的常規(guī)技術(shù)，在電場的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移一種固相支持物，然后利用抗原—抗體的特異性反應，從蛋白混合物中檢測出目標蛋白，從而定量或定性地確定正常或?qū)嶒灄l件下細胞或組織中目標蛋白的表達情況。Western blot還可用于蛋白—蛋白、蛋白—DNA和蛋白—RNA相互作用的后續(xù)分析，作為一種廉價、便捷、可靠的研究工具，將與質(zhì)譜和蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)一起在蛋白質(zhì)組時代發(fā)揮重要作用。

Western bloting的注意事項

1、為了讓實驗更加嚴謹有說服力都要設(shè)計對照實驗，對照分為：陽性對照（好有標準品（比如β-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關(guān)對照（用無關(guān)抗體）

2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇適當?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實驗結(jié)果以及背景

3、實驗設(shè)計時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實驗帶來不確定性。

4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實驗結(jié)果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。

5、電泳、轉(zhuǎn)膜時特別要注意正負極，電壓電流都不能過高；轉(zhuǎn)膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在10度以下，冰浴為宜。

6、封閉時一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是生物素標記的二抗就不宜用牛奶，因為牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。

7、加一抗二抗要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；