乙酰輔酶羧化酶（ACC）活性檢測(cè)試劑盒（酶法）說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC6020

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1．提取液二：為易揮發(fā)試劑，用完后盡快密封，-20℃保存。

2．提取液的配制：按提取液一：提取液二=990μL：10μL（共1mL，約1T）的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一中。

3．試劑一：臨用前將試劑一B全部倒入試劑一A，充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

4．試劑二：試劑放于棕色瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中，臨用前加入12mL蒸餾水，充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

5．試劑三稀釋液：臨用前離心，根據(jù)樣本量按照試劑三：蒸餾水=1μL：50μL（共51μL，約1T）的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

6．試劑四稀釋液：臨用前離心，根據(jù)樣本量按照試劑四：蒸餾水=4μL：500μL（共504μL，約10T）的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

7．試劑五：試劑放于棕色瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中，臨用前加入12mL蒸餾水；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

8．試劑六：試劑放于棕色瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中，臨用前加入12mL蒸餾水；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

9．工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑三稀釋液：試劑四稀釋液：試劑五：試劑六=50μL:50μL:200μL:200μL（共500μL，約1T）的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

乙酰輔酶羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶羧化生成丙二酰輔酶，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC能夠催化乙酰輔酶、NaHCO₃和ATP生成丙二酰輔酶、ADP和無(wú)機(jī)磷，丙 酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一

步依次催化NADH生成NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映ACC活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、分析天平、低溫離心機(jī)、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、漩渦震蕩儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌或細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清（漿）：直接測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 臨用前根據(jù)樣本量將試劑一和工作液預(yù)熱5min。

3、 操作表：(在1mL石英比色皿/1.5mL離心管中依次加入下列試劑)

三、ACC活性計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每毫克組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADH轉(zhuǎn)化為1nmol NAD⁺為一個(gè)酶活單位。

ACC活性（U/mg prot）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T=321.5×?A÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADH轉(zhuǎn)化為1nmol NAD⁺為一個(gè)酶活單位。

ACC酶活（U/g 質(zhì)量）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=321.5×?A÷W

3. 按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活定義：每10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADH轉(zhuǎn)化為1nmol NAD⁺為一個(gè)酶活單位。

ACC酶活（U/10⁶ cell）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷（N×V樣÷V樣總）÷T =321.5×?A÷N

4. 按血清（漿）體積計(jì)算：

酶活定義：每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADH轉(zhuǎn)化為1nmol NAD⁺為一個(gè)酶活單位。

ACC酶活（U/mL）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷V樣÷T=321.5×?A

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；?：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：1mL石英比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量，以10⁶計(jì)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1、 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋

中，在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

2、 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3、 當(dāng)A1測(cè)定空白時(shí)，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定；當(dāng)樣本?A過(guò)小時(shí)，建議增大樣本量或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，注意同步修改計(jì)算公式。

4、 由于提取液一中含有蛋白（約1mg/mL），若需要測(cè)定樣本的蛋白濃度，需要減去提取液本身的蛋白濃度。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1044g小鼠腦組織，加入1mL提取液，進(jìn)行勻漿、離心、取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，用1mL石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA=（A1測(cè)定-A2測(cè)定）-（A1空白-A2空白）=（1.520-0.229）-（1.489-1.456）=1.258，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ACC酶活（U/g 質(zhì)量）=321.5×?A÷W=3874.01 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1041g向日葵葉片組織，加入1mL提取液，進(jìn)行勻漿、離心、取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，用1mL石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA=（A1測(cè)定-A2測(cè)定）-（A1空白-A2空白）=（1.477-1.374）-（1.489-1.456）=0.070，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ACC酶活（U/g 質(zhì)量）=321.5×?A÷W=216.19 U/g 質(zhì)量。

3. 取3×10⁶個(gè)Raw細(xì)胞，加入1mL提取液，進(jìn)行勻漿、離心、取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，用1mL石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA=（A1測(cè)定-A2測(cè)定）-（A1空白-A2空白）=（1.464-1.255）-（1.489-1.456）=0.176，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活得：

ACC酶活（U/10⁶ cell）=321.5×?A÷N=18.86 U/10⁶ cell。

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