淀粉脫分支酶（DBE）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC4255
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取1支加入1.5 mL試劑一，充分溶解后待用，用不完的試劑2-8℃保存4周；

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg無水*萄糖。臨用前加入1 mL蒸餾水溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃可保存兩周；

產(chǎn)品說明：
淀粉脫分支酶（starch debranching enzyme，DBE）能夠?qū)Ｒ?、高效的裂解支鏈淀粉?span style="font-family: Times New Roman, Times, serif;">α-1,6-糖苷鍵，對淀粉的結(jié)構(gòu)起“修飾"的作用，淀粉脫分支酶在調(diào)整支鏈淀粉側(cè)鏈的鏈長方面起著關(guān)鍵作用，淀粉分支酶和淀粉脫分支酶的平衡使得支鏈淀粉合成。

DBE催化支鏈淀粉產(chǎn)生還原糖，其與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成棕紅色物質(zhì)，通過測定其在540nm下吸光值變化可計算得DBE活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式低溫離心機、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積（mL）為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后15000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
2、細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后15000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3、液體：直接檢測。（若溶液有渾濁則離心后取上清測定）
二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2. 將10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需40µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1. 取100μL樣本沸水浴5min（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫后，8000g，常溫離心5min，取上清備用。

2. 操作表 (在0.5mL或1.5mL離心管中) ：

注意：37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)2h后，離心管底部可能有沉淀，無需離心，直接進(jìn)入下一步試驗即可。
三、DBE活性計算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）。

1. DBE活性的計算：

（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每小時分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個酶活力單位。
DBE酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=0.5x×Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每克樣本每小時分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個酶活力單位。
DBE酶活（U/g質(zhì)量）=x×V提取÷W÷T=0.5x÷W
（3）按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計算
酶活定義：每10⁴個細(xì)胞每小時分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個酶活力單位。
DBE酶活（U/10⁴ cell）=x×V提取÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）÷T=0.5x÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）
（4）按液體體積計算
酶活定義：每mL樣本每小時分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個酶活力單位。
DBE酶活（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=0.5x
V提?。禾崛∫后w積，1mL；V樣：加入的樣本體積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：2h。
注意事項：

1. A大于1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式。

2. 建議每次實驗沸水浴后冷卻時間保持一致。

實驗實例：

1. 取0.1g大米，加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，然后15000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測，取上清后再用提取液稀釋10倍，之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA=A測定管-A對照管=0.243-0.111=0.132，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3913x-0.138，計算x=0.194，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

DBE酶活（U/g質(zhì)量）=0.5x÷W×10（稀釋倍數(shù)）=9.7 U/g質(zhì)量。
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