精*酸（Arg）含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5630

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入1.5mL無水乙醇，充分溶解。-20℃可以保存4周。

2、 工作液配制：根據(jù)樣本量按照試劑一：試劑二=50μL：450μL（500μL，2T）的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、 標準品：臨用前加入0.918 mL蒸餾水，充分溶解，配制成62.5 μmol/mL 精*酸標準溶液。臨用前取10μL的62.5 μmol/mL 精*酸標準溶液于EP管中，加入790 μL蒸餾水充分溶解，配制成0.78125 μmol/mL的精*酸標準溶液。

產(chǎn)品說明：

精*酸(Arginine)是人體和動物體內(nèi)的半必需氨基酸，在機體中參與蛋白質的合成代謝、以及多胺和NO的合成，起著重要的生理作用。精*酸有降低血壓的作用，在體內(nèi)精*酸能夠分解成為一氧化氮，一氧化氮能松弛血管壁平滑肌，調(diào)節(jié)血管彈性，對血管內(nèi)膜有修復作用。精*酸能夠刺激并誘導腎上腺激素分泌，從而降低血糖，減少身體中脂肪酸的生產(chǎn)，能使高血糖患者的血糖降至正常水平。

精*酸在堿性介質中與甲萘酚和次氯酸鈉生成紅色生成物，其在525nm處有特征吸收峰，以此計算精*酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、渦旋混勻儀、分析天平、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水、無水乙醇和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

細胞：按照細胞數(shù)量（10⁶個）：提取液一體積（mL）為5~1：1的比例（建議5百萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至525nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 在1.5mLEP管中按下表步驟加樣：

三、精*酸（Arg）含量計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

Arg含量（μmol/mg prot）=C_標準×?A_測定÷?A_標準×V_樣÷（Cpr×V_樣）×F = 0.781×?A_測定÷?A_標準÷Cpr×F

(2) 按樣本質量計算

Arg含量（μmol/g 質量）= C_標準×?A_測定÷?A_標準×（V_上清+V_提取液二）÷（W×V_上清÷V_提取液一）×F

= 0.928×?A_測定÷?A_標準÷W×F

(3) 按細菌或細胞數(shù)量計算

Arg含量（μmol/10⁶ cell）= C_標準×?A_測定÷?A_標準×（V_上清+V_提取液二）÷（N÷V_上清÷V_提取液一）×F
= 0.928×?A_測定÷?A_標準÷N×F

(4) 按液體體積計算

Arg含量（μmol/mL）= C_標準×?A_測定÷?A_標準×（V_上清+V_提取液二）÷（V_液體×V_上清÷（V_液體+V_提取液一））×F

= 10.205×?A_測定÷?A_標準×F

C_標準：精*酸標準溶液濃度，0.78125 μmol/mL；V_樣：反應體系中加入的樣本體積，0.25mL；V_上清：提取時上清的體積，0.8mL；V_提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V_提取液一：加入提取液一的體積，1mL；V_液體：液體樣本體積，0.1mL；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細胞或細菌數(shù)量，以10⁶計；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 如果?A_測定大于0.8，可以用蒸餾水對樣本進行稀釋；如果?A_測定小于0.01，可以加大樣本量。最終計算時同步修改計算公式。

2. 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。

實驗實例：

1、 稱取0.1162g小鼠腎臟組織，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A_測定=A_測定-A_空白=0.582-0.227=0.355，?A_標準=A_標準-A_空白=0.727-0.227=0.5，帶入公式計算：

Arg含量（μmol/g 質量）=0.928×?A_測定÷?A_標準÷W=5.670 μmol/g 質量。

2、 稱取0.1186g花生組織，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A_測定=A_測定-A_空白=0.661-0.227=0.434，?A_標準=A_標準-A_空白=0.727-0.227=0.5，帶入公式計算：

Arg含量（μmol/g 質量）=0.928×?A_測定÷?A_標準÷W=6.792 μmol/g 質量。

3、 取人血清按按前處理和實驗步驟進行實驗，用1mL玻璃比色皿測得計算?A_測定=A_測定-A_空白=0.314-0.227=0.087，?A_標準=A_標準-A_空白=0.727-0.227=0.5，帶入公式計算：

Arg含量（μmol/mL）=10.205×?A_測定÷?A_標準×F =1.776 μmol/mL。

參考文獻：

[1] Francis P S, Barnett N W, Foitzik R C, et al. Chemiluminescence from the Sakaguchi reaction [J]. Analytical Biochemistry, 2004, 329(2):340-341.

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