脂質(zhì)過氧化物（LPO）含量檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC5245

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取1瓶試劑二加入7mL 蒸餾水，此試劑較難溶，可以在70℃加熱并劇烈振蕩以促進(jìn)溶解，或者通過超聲處理以促進(jìn)溶解。每次用前需檢查是否有粉劑析出。用不完的試劑可在2-8℃中保存一個月。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：為1000nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液

產(chǎn)品說明：

脂質(zhì)過氧化物（lipid hydroperoxide LPO）是不飽和脂肪酸鏈經(jīng)自由基或活性氧作用后產(chǎn)生的過氧化物。病理情況下，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強可導(dǎo)致原本低含量的LPO升高。LPO含量升高會對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷，LPO含量與機體免疫系統(tǒng)和衰老密切相關(guān)。

LPO在酸性條件下加熱產(chǎn)生丙二醛（MDA），MDA與硫代巴*妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成棕紅色物質(zhì)三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二*），其最大吸收波長在 532nm，進(jìn)行比色后可估測樣本中LPO的含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲波破碎儀、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照樣本質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取

液）加入提取液，冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2、細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）加入提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲 3s，間隔 7s，總時間3min），8000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

3、培養(yǎng)液或其他液體：直接檢測。若溶液渾濁則離心后取上清進(jìn)行測定。

二、測定步驟

1、可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至532nm和600nm，可見分光光度計需用蒸餾水調(diào)零。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)液為1000nmol/mL的MDA標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)液用稀釋液稀釋至20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625nmol/mL備用，具體稀釋可參考下表。

備注：實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需120µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3、在EP管中按下表步驟加樣：

     將混合液在 45℃（植物樣本）或100℃（其他樣本）水浴60min 后（標(biāo)準(zhǔn)管在兩個溫度水浴均可），置于冰浴中冷卻，8000g，常溫，離心 10min。吸取200μL上清液于微量玻璃比色皿或 96 孔板中，測定各樣本在 532nm和600nm處的吸光度。分別計算 ΔA=（A532_測定-A532_對照）-（A600_測定-A600_對照），ΔA標(biāo)準(zhǔn)=（A532_{標(biāo)準(zhǔn)}-A532_空白）-(A600_{標(biāo)準(zhǔn)}-A600_空白）（標(biāo)準(zhǔn)曲線，空白管和對照管只需做 1-2 次）。

三、LPO含量的計算

1. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA（y，ΔA）代入公式計算樣本濃度（x，nmol/mL）

2. 按樣本蛋白質(zhì)濃度計算

LPO含量（nmol/mg prot）= x×V樣÷（Cpr×V樣）= x÷Cpr

3. 按樣本質(zhì)量計算

LPO含量（nmol/g 質(zhì)量）= x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）= x÷W

4. 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算

LPO含量（nmol/10⁴cell）= x×V樣÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個））= x÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

5. 按照液體樣本體積計算

LPO含量（nmol/mL）= x

V樣：加入樣本體積，0.12mL，V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項：

1. 待測液如果有密集小氣泡，建議靜置20min左右等待氣泡消失再測，以免影響測定結(jié)果，如果有少量氣泡可以通過低速離心或輕磕等方式來消除。

2. 待測液如果尚未澄清，可吸取上清液后再次離心。

3. 為防止水浴60min過程中水分散失，建議使用螺旋管或用封口膜給EP管纏口。

4. 如果用高溫助溶試劑二，需要待其冷卻至室溫后再使用。

5. 如果測定吸光值過低或接近空白，適當(dāng)延長反應(yīng)時間或加大樣本量后，重新測定。如果吸光值過大或超過檢測范圍（A532＞1.5或者ΔA＞1.5時），建議將樣本適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 稱取0.1192 g綠蘿，加入1mL提取液，冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測定并進(jìn)行計算A532_測定= 0.139，A532_對照= 0.042，A600_測定= 0.054，A600_對照= 0.039，?A=0.082，將?A代入標(biāo)曲公式y = 0.0218x - 0.0054，R²=0.9997，得出x=4.009，按樣本質(zhì)量計算得：

LPO含量（nmol/g 質(zhì)量）= x÷W = 33.63 nmol/g 質(zhì)量。

2. 稱取0.1209g大鼠心臟，加入1mL提取液，冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測定并進(jìn)行計算A532_測定 = 0.097，A532_對照 = 0.047，A600_測定 =0.065，A600_對照 = 0.042，?A=0.027，將?A代入標(biāo)曲公式y = 0.0525x - 0.0007，R²=0.9993，得出x=0.528，按樣本質(zhì)量計算得：

LPO含量（nmol/g 質(zhì)量）= x÷W = 4.367 nmol/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

Hiroshi Ohkawa, Nobuko Ohishi, Kunio Yagi, Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction[J], Analytical Biochemistry,1979.

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