北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5220-50T/48S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1110
010-50973130
產品分類
多胺氧化酶（PAO）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5220
規(guī)格：50T/48S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體35mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體3.5mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體3.5mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體3mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 工作液：臨用前根據(jù)實驗所需量按照試劑一：試劑二：試劑三=600μL：60μL：60μL（約1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
產品說明：
多胺氧化酶（Polyamine Oxidases，PAO）是催化生物體內多胺氧化的關鍵酶，多胺能夠與核酸、蛋白質、細胞膜分子互作，直接影響細胞的生長、分化和凋亡，而PAO可通過調節(jié)細胞內多胺水平和生成物的濃度，參與各種植物體對逆境脅迫的反應和生長發(fā)育過程。
PAO催化多胺氧化生成H2O2，過氧化物酶在有氧存在時催化H2O2分解，同時將鄰聯(lián)茴香胺氧化生成有色物質，在500nm處有特征吸收峰，顏色深淺與PAO活性成線性關系
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式低溫離心機、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本的處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照組織質量（g）︰提取液體積（mL）為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿。于4℃，10000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
2. 細胞或細菌：按照細胞或細菌數(shù)量（104個）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬細胞或細菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間3min），于4℃，10000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
3. 液體：直接測定。若有沉淀，離心后測定。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至500nm，蒸餾水調零。
2、 測定前將工作液37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱預熱10min以上。
3、操作表：在EP管中分別加入下列試劑：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 空白管 |
工作液 | 700 | 700 |
試劑四 | 50 | 50 |
上清液 | 250 | - |
蒸餾水 | - | 250 |
充分混勻，于500 nm處測定30s吸光度A1，然后在37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱反應1h，測定1h30s吸光度A2，計算ΔA=A2-A1?？瞻坠苤恍枳?/span>1-2次。若反應1h后有沉淀，4℃離心后取上清測定。 | ||
三、計算公式
1. 按照樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義：在每毫升反應體系中，每毫克蛋白每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.001定義為一個酶活力單位。
PAO活性（U/mg prot）=ΔA×V反÷（V樣×Cpr）÷T÷0.001×F=66.67×ΔA÷Cpr×F
2. 按照樣本質量計算
酶活單位定義：在每毫升反應體系中，每克組織每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.001定義為一個酶活力單位。
PAO活性（U/g 質量）=ΔA×V反÷（W÷V提×V樣）÷T÷0.001×F=66.67×ΔA÷W×F
3. 按照細胞數(shù)量計算
酶活單位定義：在每毫升反應體系中，每104 個細胞或細菌每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.001定義為一個酶活力單位。
PAO活性（U/104 cell）=ΔA×V反÷（500÷V提×V樣）÷T÷0.001×F=0.133×ΔA×F
4. 按液體體積計算
酶活單位定義：在每毫升反應體系中，每毫升液體樣本每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.001定義為一個酶活力單位。
PAO活性（U/mL）=ΔA×V反÷V樣÷T÷0.001×F=66.67×ΔA×F
V反：反應總體積，1.0mL；V樣：加入樣本上清體積，0.25mL；V提：加入提取液的體積，1mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；500：細胞或細菌數(shù)量，500萬；T：反應時間，60min；F：稀釋倍數(shù)。
實驗實例：
1. 稱取0.1023g珍珠梅葉片加入1mL提取液進行樣本處理，離心取上清后按測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得A1=0.256，A2=0.637，ΔA=A2-A1=0.381，根據(jù)計算公式得：
PAO活性（U/g 質量）=66.67×ΔA÷W=66.67×0.381÷0.1023=248.302 U/g 質量
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