葡萄糖含量檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2500
規(guī)格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
1、試劑一：1μmol/mL葡萄糖溶液；
2、混合試劑的配制：使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合，用多少配多少。
產品說明：
葡萄糖不僅是細胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產生葡萄糖。就哺乳動物而言，葡萄糖不僅是大腦神經系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織等的能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關。
葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產生*；過氧化物酶（Peroxidase，POD）催化*氧化4-氨基安替*林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在505 nm 有特征吸收峰。


技術指標：
低檢出限：0.01 μmol/mL
線性范圍：0.015-3 μmol/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機、超聲破碎儀、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織的處理：按照組織質量（g）：蒸餾水體積（mL）為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），研磨成勻漿，置沸水浴中煮沸10 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫后，8000g，25℃離心10min，取上清液備用。

2. 細菌或細胞處理：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細菌或細胞加入1mL 蒸餾水），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3 s，間隔10 s，重復30次），置沸水浴中煮沸10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫后，8000g，25℃離心10min，取上清液備用。
二、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至505nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定（在1.5mL EP管中依次加入下列試劑）：

渦旋混勻，置于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱反應15min后，于505nm波長處讀取吸光度A，分別記為A空白、A標準和A測定。計算ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標準=A標準-A空白。（空白管和標準管只需測1-2次）。
三、葡萄糖含量計算

1. 按蛋白濃度計算

葡萄糖含量（µmol/mg prot）= C ×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（Cpr×V樣）=ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

1. 按樣本質量計算

葡萄糖含量（µmol/g 質量）= C ×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（W÷V樣總×V樣）= ΔA測定÷ΔA標準 ÷W

1. 按細菌或細胞數(shù)量計算

葡萄糖含量（µmol/10⁶ cell）= C ×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（5÷V樣總×V樣）= 0.2×ΔA測定÷ΔA標準
C：葡萄糖溶液濃度，1µmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入的樣本體積，100µL=0.1mL；V樣總：樣本總體積，1mL；W：樣本質量，g；5：細菌或細胞數(shù)量（以10⁶計），5×10⁶個。
注意事項：
若（A測定-A空白）小于0.005，建議加大提取樣本質量（或細胞數(shù)量）或者樣本上清液的加入量；（A測定-A空白）大于1.5，將上清液用蒸餾水稀釋即可。計算公式中注意乘以稀釋倍數(shù)。
實驗實例：

1. 
   

1. 
   

2. 取0.1g小鼠肝臟加入1mL蒸餾水進行前處理步驟，離心取上清；再用蒸餾水稀釋2倍后按測定步驟測定，用玻璃比色皿得吸光值ΔA測定=A測定-A空白=0.758-0.006=0.752，ΔA標準=A標準-A空白=0.600-0.006=0.594。按樣本質量計算

3. 
   

葡萄糖含量（μmol/g 質量）= ΔA測定÷ΔA標準÷W×2（稀釋倍數(shù)）=0.752÷0.594÷0.1×2= 25.320 μmol/ g 質量

1. 
   

1. 
   

2. 取0.1g綠蘿葉片加入1mL蒸餾水進行前處理步驟，離心取上清后按測定步驟測定，用玻璃比色皿測得吸光值ΔA測定=A測定-A空白=0.539-0.006=0.533，ΔA標準=A標準-A空白=0.600-0.006=0.594。按樣本質量計算

3. 
   

葡萄糖含量（μmol/g 質量）= ΔA測定÷ΔA標準÷W=0.533÷0.594÷0.1=8.972 μmol/ g 質量

1. 
   

1. 
   

2. 取5百萬Jurkat細胞樣本加入1mL蒸餾水進行前處理步驟，離心取上清后按測定步驟測定，用玻璃比色皿測得吸光值ΔA測定=A測定-A空白=0.018-0.006=0.012，ΔA標準=A標準-A空白=0.600-0.006=0.594。按細胞數(shù)量計算

3. 
   

葡萄糖含量（μmol/10⁶ cell)  = 0.2×ΔA測定÷ΔA標準=0.2×0.012÷0.594=4.040×10^-3 μmol/10⁶ cell
相關發(fā)表文獻：
[1] Meixi Peng, Dan Yang, Yixuan Hou,et al. Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion. Cell Death and Disease. March 2019; (IF5.959)
[2] Jing Li,Yabing Duan,Chuanhong Bian,et al. Effects of validamycin in controlling Fusarium head blight caused by Fusarium graminearum: Inhibition of DON biosynthesis and induction of host resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. January 2019; 153:152-160. (IF2.87)
參考文獻：
[1] Basagni U, Bonicolini F. Ready to use liquid reagent for determining the glucose content in blood: U.S. Patent 5,077,199[P]. 1991-12-31.
[2] Kabasakalian P, Kalliney S, Westcott A. Enzymatic blood glucose determination by colorimetry of N, N-diethylaniline-4-aminoantipyrine[J]. Clinical chemistry, 1974, 20(5): 606-607.
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