北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5350-50T/24S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1874
010-50973130
產品分類
D-乳酸（D-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC5350
規(guī)格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體12 mL×1瓶 | |
標準品 | 液體1mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前取一支加入160μL蒸餾水溶解。2-8℃可以保存4周（該試劑為凍干試劑，可能存在肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現象，此現象不影響使用，實際質量相同）；
2、 試劑二工作液的配制：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：90μL（1T）的比例配制，現用現配，用多少配多少；
3、 試劑三：臨用前加入15 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃保存4周；
4、 標準品：1000μmol/mL D-乳酸標準液。臨用前取20μL 1000μmol/mL D-乳酸標準液和1980μL蒸餾水混合配成10μmol/mL 標準溶液；再吸取20μL 10μmol/mL 標準溶液和620μL蒸餾水混合配成0.3125μmol/mL 標準溶液備用。
產品說明：
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質代謝及細胞內能量代謝密切相關，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。D-乳酸在D-乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD+還原生成NADH和H+，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應，產生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰，據此可計算D-乳酸含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細胞破碎儀、離心機、1mL玻璃比色皿、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)
箱、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
細胞：按照細胞數量（104個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，12000g離心10min后取上清待測。
注：提取液二需緩慢加入，加入后會產生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。
二、測定步驟
1、分光光度計預熱30min以上，波長調至450nm，蒸餾水調零。
2、加樣表：（按順序將下列試劑加在EP管中）
測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 | |
樣本 | 100 | 100 | - | - |
標準溶液 | - | - | 100 | - |
蒸餾水 | - | 100 | - | 100 |
試劑一 | 450 | 450 | 450 | 450 |
試劑二工作液 | 100 | - | 100 | 100 |
試劑三 | 200 | 200 | 200 | 200 |
試劑四 | 150 | 150 | 150 | 150 |
充分混勻，于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱避光準確反應30min，取全部反應液到1mL比色皿中，于450nm處測定吸光值，分別記為A測定管，A對照管，A標準管，A空白管，計算ΔA測定=A測定管-A對照管；ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設置一個對照管，空白管和標準管只需測定1-2次。 | ||||
三、D-乳酸含量的計算
1. 按照蛋白含量計算
D-LA含量（μmol/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（V樣本×Cpr）
= 0.3125×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
2. 按照樣本質量計算
D-LA含量（μmol/g 質量）
= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）
=0.3711×ΔA測定÷ΔA標準÷W
3. 按照細胞數量計算
D-LA含量（μmol/106 cell）
= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）
= 0.3711×ΔA測定÷ΔA標準÷N
4. 按照液體體積計算
D-LA含量（μmol/mL）
=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]
=4.082×ΔA測定÷ΔA標準
C標準：標準溶液濃度，0.3125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.1mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細胞數量，以106計；V液體：液體樣本體積，0.1mL。
注意事項：
1. 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。
2. ΔA測定的測定范圍在0.01-1.2之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計算公式。
實驗實例：
1、 取0.104g兔肌肉加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測定步驟操作，使用比色皿測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.637-0.308=0.329，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.636-0.124=0.512，按照樣本質量計算含量得：
D-LA含量（μmol/g 質量）= 0.3711×ΔA 測定÷ΔA標準÷W =2.2929 μmol/g質量。
2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用比色皿測得計算ΔA測定管=A測定管-A對照管=0.356-0.302=0.054，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.636-0.124=0.512，按照液體體積計算含量得：
D-LA含量（μmol/mL）=4.082×ΔA 測定÷ΔA標準=0.4305 μmol/mL。
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