磷酸化蛋白提取試劑盒

操作方法：

1、組織總蛋白的提取

1) 在 1ml 的冷裂解液中各加入 10ul 的磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和 PMSF；混勻，放置在冰上 備用；

2) 稱(chēng)取 0.1g 的新鮮組織，放置于玻璃勻漿器的入口緩沖處，用眼科剪將組織塊盡可能的剪碎，然 后加入 0.5-1ml 的新配置的裂解液，研磨直沒(méi)有明顯的組織塊，這個(gè)過(guò)程注意冰上操作；

3) 將組織勻漿液移入 1.5ml 的 EP 管中，4 ℃ 12000g 離心 30min；

4) 吸取上清新的管中；

5) 進(jìn)行蛋白定量或者變性進(jìn)行蛋白實(shí)驗(yàn)。 （提取好的蛋白建議保存于-80℃，即用即取，避免反復(fù)凍融，避免長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。）

2、細(xì)胞總蛋白的提取

1) 裂解液的用量：107個(gè)細(xì)胞需要裂解液 1ml；

2) 貼壁細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，用冷的 PBS 洗兩次，棄去 PBS，然后加入計(jì)算好的細(xì)胞裂解液；在冰 上用細(xì)胞刮刀進(jìn)行刮離細(xì)胞，將刮離的細(xì)胞裂解液移入 EP 管中，顛倒裂解 20-30min。

3) 懸浮細(xì)胞：4℃ 400g 離心收集細(xì)胞，用冷的 PBS 洗兩次細(xì)胞，同樣按細(xì)胞數(shù)加入裂解液，渦旋 10s，放置冰上裂解 10min，重復(fù) 3-4 次；

4) 裂解完畢之后，將細(xì)胞裂解液 4 ℃12000g 離心 30min；

5) 將上清移入新的 EP 管中；進(jìn)行蛋白定量或者變性進(jìn)行蛋白實(shí)驗(yàn)。 （提取好的蛋白建議保存于-80℃，即用即取，避免反復(fù)凍融，避免長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。）

注意事項(xiàng)：

1. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程，所有試劑都要需要預(yù)冷或者即融，保證操作過(guò)程中的低溫環(huán)境。

2. PSMF（有毒）現(xiàn)用現(xiàn)加，因?yàn)?PMSF 在水溶液中會(huì)快速降解。

相關(guān)文獻(xiàn)：

《Proanthocyanidins Protect against β-Hydroxybutyrate-Induced Oxidative Damage in Bovine Endometrial Cells》 作者:Xi Cheng,Shuhua Yang,Chuang Xu, Lanzhi Li,Yi Zhang, Yang Guo, Cai Zhang, Peng Li, Miao Long,Jianbin He 期刊:Molecules. 影響因子:3.098 PMID:30678309
《Luteoloside attenuates neuroinflammation in focal cerebral ischemia in rats via regulation of the PPARγ/Nrf2/NF-κB signaling pathway》 作者:Qiaoling Li,Zixia Tian,Minghui Wang,Jiejian Kou,Chunli Wang,Xuli Rong,Jing Li,Xinmei Xie,Xiaobin Pang 期刊:International Immunopharmacology 影響因子:3.361 PMID:30502652
《β?elemene inhibits oxygen?induced retinal neovascularization via promoting miR?27a and reducing VEGF expression》 作者:Weilai Zhang, Lei Chen ,Jin Geng, Limin Liu, Li Xu 期刊:Molecular Medicine Reports 影響因子:1.851 PMID:30664207
 

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